大豆多肽屬于生物活性肽，是以大豆蛋白為主要原料，經(jīng)過提取分離、純化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白質(zhì)水解物)，通常以由 3～6個氨基酸組成的小分子肽為主，還含有少量游離氨基酸、糖類、水分和無機鹽等。大豆多肽具有較高的營養(yǎng)價值，其氨基酸組成與大豆蛋白完全一樣，是一種理想的新型大豆深加工產(chǎn)品【1】。
大豆蛋白經(jīng)酶水解后，其產(chǎn)物中含有多種生理活性肽小分子大豆肽不僅溶解性好、黏度低，而且在人體內(nèi)消化吸收快。另外，還具有降血壓、降血脂、降膽固醇、促進礦物質(zhì)吸收、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌、抗輻射、減肥、調(diào)節(jié)血糖濃度、抗疲勞、低過敏性、促進微生物的生長發(fā)育和代謝等多種不同的生物活性【2】。
大豆蛋白酶水解產(chǎn)物在食品工業(yè)中一般應用于飲料、奶粉奶酪乳制品和代乳品中，也可添加在肉類食品和醋、醬油等發(fā)酵食品中，可以用來生產(chǎn)面條、饅頭、面包以及冷凍食品. 以顯著提高產(chǎn)品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，并增強產(chǎn)品的口感風味【1】【2】。
《GB/T 22492-2008 大豆肽粉》為生產(chǎn)企業(yè)提供一個通用的產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)范，但對于大豆肽粉在大豆蛋白提取、酶解、發(fā)酵、肽的過膜分離(超濾、微濾、納濾)、色譜分離(液相、GPC)、脫色、脫苦等工藝控制環(huán)節(jié)沒有指導方法。
本文探索了豆粕蛋白酶解粗肽的反相液相色譜分析方法，操作簡便，通用性好，適用于質(zhì)控環(huán)節(jié)，為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測序提供了先導方法。
2、樣品前處理
2.1 試劑配制
流動相：取3mL色譜級甲酸加入1L色譜級乙腈中，無需抽濾，混勻超聲10min；取3mL色譜級甲酸加入1L超純水中，無需抽濾，混勻超聲10min。
2.2 試劑配制
樣品配制：樣品為豆粕蛋白的酶解產(chǎn)物，未經(jīng)過膜處理，多肽分子量分布很廣的粗品。分別稱取大豆肽1號2號3號試樣各20mg于三個2ml液相小瓶中，各加超純水1ml，渦旋1min，用0.22um尼龍66濾頭過濾，待用。
3、色譜條件
3.1 儀器信息
儀器硬件：ThermoFisher Vanquish液相色譜儀
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3.1；中藥指紋圖譜相似度評價軟件
3.2 方法信息
色譜柱：Accucore Vanquish C18 2.1 mm×150 mm，1.5 μm(PN：27101-152130)
流動相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸乙腈溶液，
流速：0.2 mL/min，梯度程序見表1：
表1. 梯度洗脫程序
進樣量：2 µL
柱溫：30℃(still air模式)
檢測器波長：280nm
4、樣品分析譜圖及測定結(jié)果
4.1 典型色譜圖
圖1a. 大豆肽1號樣品和空白色譜圖疊圖
圖1b. 大豆肽1號224nm、280nm色譜圖及光譜信息
4.2 重復性
圖2. 大豆肽3號樣品六針連續(xù)進樣色譜、壓力疊圖
表2. 大豆肽3號樣品六針連續(xù)進樣保留時間和峰面積穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
4.3 相似度評價
借助中藥指紋圖譜相似度評價軟件，可以比較兩個譜圖之間的差異，進而了解來料大豆肽的批次間差異，為指導工藝調(diào)整提供科學直觀依據(jù)。
圖3. 大豆肽1號、2號、3號指紋圖譜和相似度評價結(jié)果
● 積分參數(shù)平滑為0.4，即加大平滑令色譜峰以峰組形式存在，數(shù)目相對減少時，以大豆肽3號為對照時，大豆肽1號的相似度為0.663，大豆肽2號的相似度為0.7。
● 針對復雜樣品，以峰組形式積分(結(jié)合平滑等參數(shù))，可以得到數(shù)目合適，又能覆蓋主要色譜峰的積分譜圖。基于此的評價結(jié)果才更為合理。
結(jié)果與討論
1、客戶樣品為豆粕蛋白酶解產(chǎn)物，未經(jīng)過膜分離，多肽分子量分布跨度大，同時不排除混有糖、蛋白、氨基酸等其他化合物。若能將樣品通過超濾膜分離凈化，按照分子量范圍分成幾組肽段，分別建立液相方法，則借助液相做質(zhì)控更科學嚴謹一些。
2、樣品前處理少，優(yōu)勢在于快捷高效，成本低，適于工廠化驗室操作，對人員要求不高。劣勢在于樣品基質(zhì)復雜、粗肽組份繁雜，對液相的穩(wěn)定性要求非常高。峰組ABCD的保留時間穩(wěn)定性在1%以內(nèi)、峰面積重現(xiàn)性在2%以內(nèi)。每組六針進樣壓力曲線都非常平穩(wěn)波動僅在0.4 bar，該方法穩(wěn)定性非常好。
3、創(chuàng)造性的首次將粗肽分析與中藥指紋圖譜相似度評價軟件相結(jié)合，可以從整體分析、在宏觀上了解粗肽批次間的差異；憑借Vanquish液相卓越的穩(wěn)定性，在變色龍軟件里平行比較兩批次樣品譜圖的細節(jié)差異。進而從宏觀和微觀兩方面入手，在調(diào)控酶解、過膜超濾、GPC分離等工藝環(huán)節(jié)中發(fā)揮指導作用。解決粗肽可視化直觀化的質(zhì)控問題。
4、做相似度評價時，建議選取成熟穩(wěn)定粗肽樣品中主要成分色譜峰或峰組作為評價標的。積分時通過加大平滑將色譜峰以峰組的形式積分，即簡化譜圖，又可提升譜圖間可比性。通常相似度0.9以上認為批次間是穩(wěn)定一致的。解決粗肽質(zhì)控評價標準的建立問題。
5、從向食品中添加大豆肽，以提升食品(代乳制品、醬油、面食等)營養(yǎng)和品質(zhì)角度來說，本法做來料質(zhì)控基本可行。從向食品中添加活性肽，打造功能性保健食品角度來說，還需進一步對來料做超濾膜分離，得到5000Da以下的肽，本法為MS友好流動相可以直接結(jié)合高分辨質(zhì)譜找到有價值的活性肽。從科研角度來說，本法基礎(chǔ)上擴展CAD電霧式檢測器，可以檢測無紫外吸收和弱紫外吸收的物質(zhì)，如氨基酸、GABA(伽馬氨基丁酸)、單糖多糖等。
6、客戶要求用Accucore 1.5 μm的色譜柱開發(fā)該方法，以期面對極其復雜樣品時，能得到較好分離度，考慮到樣品和基質(zhì)實際情況，推薦客戶試用Hypersil GOLD Peptide 1.9um，175Å色譜柱兩根串聯(lián)使用提高復雜樣品分離能力，賽默飛還有其他適合分析多肽的色譜柱，如Accucore 150 C4，Acclaim 300 C18，BioBasic 300Å等。
7、該方法操作簡單僅需過濾樣品即可，是降本又增效的液相色譜分析方案，將會對食品工業(yè)中添加粗肽、大豆肽的企業(yè)提高品控水平。
8、本文為探索性質(zhì)的實驗。為解決粗肽、大豆肽生產(chǎn)過程中部分質(zhì)控問題，提出跨界解決問題的思路，若能結(jié)合GPC做分子量分布研究，將其整合為一套完整方案，則產(chǎn)品質(zhì)控會更加全面嚴謹，終將有利于生成企業(yè)、消費者和監(jiān)管部門。
合作伙伴
李丹課題組：李丹，男，生于1972年10月；江南大學食品科學博士、韓國國立首爾大學 (Seoul National University) 食品科學與生物技術(shù)系博士后、美國佛羅里達大學 (University of Florida) 微生物與細胞科學系訪問學者；教育部新世紀優(yōu)秀人才；吉林省二級教授，吉林省有突出貢獻的中青年專業(yè)技術(shù)人才，吉林省拔尖創(chuàng)新人才二層次?，F(xiàn)任長春大學“大豆生物加工技術(shù)吉林省發(fā)改委工程實驗室”主任、“農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省教育廳重點實驗室”主任。主要從事食品科學與農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域的教學與科研工作。主持完成國家自然科學基金“面上項目”2項，主持完成科技部“國際科技合作項目”1項，主持完成“教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”和“教育部留學回國人員科研基金”項目2項，主持完成省市廳級科技計劃項目11項；在本學科國際著名SCI期刊，發(fā)表英文論文50余篇，其中在中科院學術(shù)期刊分區(qū)一區(qū)期刊發(fā)表論文18篇；獲得授權(quán)發(fā)明專利6件，獲得英國Elsevier最多引用論文獎、吉林省科技廳吉林省科技獎自然科學獎二等獎等省部級科研成果獎勵9項。
參考文獻：
【1】大豆多肽的研究進展 高蕾蕾，李迎秋2018 年第 2 期 江蘇調(diào)味副食品 總第 153 期 *? DOI: 10. 16782 /j. cnki. 32-1235 /ts. 2018. 02. 002
【2】大豆蛋白酶水解產(chǎn)物對面粉糊化特性的影響崔會娟，王璐，郭興鳳 *河南工業(yè)大學學報(自然科學版) Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition) 第 36 卷第 1 期 2015 年 2 月
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