遵循電荷異構體檢測法規(guī)
引領精準檢測技術新趨勢
近年來，蛋白類生物藥受到越來越多的關注和重視，2023年美國FDA批準的新藥和生物制品名單中有24種蛋白藥物[1]。抗體類蛋白藥物在生產、儲存和運輸過程中發(fā)生的潛在變化，可能會導致產品中發(fā)生分子量、氨基酸殘基的修飾、糖型等非均一性從而導致產生對應的電荷異構體。根據ICH Q6B的規(guī)定，生物制藥需要對電荷異構體這種產品相關物質和產品相關雜質進行質量控制，以確保產品的安全性、有效性和一致性，滿足各國藥品監(jiān)管機構的要求。
在電荷異構體的分析檢測中，全柱成像毛細管等電聚焦(icIEF)是一種不可或缺的分析手段，也是目前產品放行的法定方法。在2020版中國藥典《人用重組單克隆抗體制品總論》和2025版中國藥典公示稿《3129 單抗電荷變異體測定法》通則中都收錄了icIEF作為電荷異構體檢測的藥典標準方法。AES(艾易爾斯生物)作為行業(yè)內唯一能夠提供從載體兩性電解質、卡柱、pI 標記物到分析型、制備型和質譜在線聯機的icIEF全方面解決方案的供應商，與賽默飛強強聯手共同推出icIEF-Orbitrap的聯用分析解決方案，并與國內外生物制藥客戶合作發(fā)表系列研究成果，引領行業(yè)的發(fā)展[2-11]。
CEInfinite全柱成像毛細管等電聚焦電泳與Orbitrap Exploris系列超高分辨液質聯用儀
應對電荷異構體分析三大難題
提升生物制藥質控需求
隨著監(jiān)管要求的提高，藥物研發(fā)階段和某些生產控制階段需要制備毫克級電荷異構體，以便用于肽圖分析、修飾位點確定和效力測定。然而，現有的icIEF技術在制備效率低、難以獲得毫克級電荷異構體和制備重現性不佳方面存在行業(yè)難題。針對這些痛點，賽默飛與AES合作帶來了創(chuàng)新解決方案。
應對挑戰(zhàn)一
攻克毫克級電荷異構體制備挑戰(zhàn)，引領制備技術新突破
AES的CEInfinite平臺的制備型icIEF功能，能夠在無人值守的情況下實現高效且可重現的餾分收集。每次運行可自動完成足量的餾分收集，滿足肽圖譜分所需且能夠準確定義每個餾分的間隔，實現每天20-30次的高通量操作，能夠快速提供大量可重現的樣品用于后續(xù)在Orbitrap高分辨質譜上完成肽圖測試，為新藥的快速上市和生產流程的優(yōu)化提供強有力的支持。
高重復性：在遷移過程中可以保持峰形，從而確保高重現性
高分辨率和高純度：pI差異>0.1 的峰即可分餾制備，純度可以做到100%
高產量：制備量高達 8 μg/次，250 μg/天，4天即可獲得 1 mg
減少勞動力：自動化、溫控，并盡量減少用戶干預
圖1: CEInfinite采用壓力推動的制備模式，可以實現液相色譜級別的穩(wěn)定性和重現性
圖2: 離線制備 Pembrolizumab 電荷異構體[5]
圖3: 制備獲得的Pembrolizumab 電荷異構體的純度確認[5]
圖4: Pembrolizumab 電荷異構體中氧化修飾的信息匯總[6]
應對挑戰(zhàn)二
提升電荷異構體分析的分辨率和靈敏度
除了肽圖分析以外，CEInfinite icIEF 與Orbitrap 超高分辨質譜儀聯用的優(yōu)勢，包括采用 Denative MS 和Native MS 模式，實現 icIEF-Native MS 以進行各種蛋白藥物進行有效分析，這種集成解決方案不僅提升了蛋白質電荷異構體分析的分辨率和靈敏度，還確保了操作的高效性和數據的合規(guī)性，為生物制藥行業(yè)提供了一個先進、可靠的分析平臺[10]。
高分辨率、高靈敏度的質譜分析：Orbitrap具有極高的分辨率和靈敏度，使得蛋白質電荷異構體的分離和識別更加精準，能夠檢測到低豐度的電荷異構體，確保在復雜樣品中獲得可靠的數據，有助于發(fā)現和分析低濃度的蛋白質變體，提升分析的全面性。
Native MS 模式：獨一無二的icIEF-Native MS 的模式，能夠在保持樣品天然狀態(tài)的情況下進行質譜分析。這對于 ADC藥物的電荷異構體表征尤其重要，能夠準確地分析復雜生物藥物的電荷異構體，為藥物開發(fā)和質量控制提供了強有力的工具。
統(tǒng)一管控滿足合規(guī)要求：變色龍軟件可以統(tǒng)一管理 CEInfinite icIEF 和 Orbitrap 的操作，提供強大的數據處理和管理功能，能夠有效存儲和分析數據，并提供數據審計跟蹤，可自動生成合規(guī)性文檔和記錄，滿足行業(yè)標準和法規(guī)要求。
圖5: 變色龍同時控制CEInfinite icIEF 和 Orbitrap Exploris 240[10]
圖6: 變色龍支持CEInfinite icIEF
的數據采集和數據處理[10]
圖7: CEInfinite icIEF與Orbitrap聯用在線檢測NIST mAb[2]
應對挑戰(zhàn)三
藥物結構復雜性帶來的電荷異構體分離挑戰(zhàn)
隨著蛋白藥物從最初單抗已經發(fā)展出了抗體偶聯藥物、小分子偶聯藥物、多肽偶聯藥物、抗體寡核苷酸偶聯物等各種新穎的藥物，這些藥物結構的復雜性也給icIEF的分離帶來了挑戰(zhàn)，而只有得到很好的分離才能進入下一步的制備工作，這里面最核心就是載體兩性電解液。
利用AESlyte®的載體兩性電解質能夠顯著提高icIEF方法的分辨率，與傳統(tǒng)載體兩性電解質相比，AESlyte系列不僅具有更嚴格的批次間質量控制，還能夠在復雜樣品中實現更高的基線分辨率。另外通過優(yōu)化不同的AESlyte組合以及定制化載體兩性電解質，CEInfinite平臺可以精確分離每個電荷異構體，從而為后續(xù)的肽圖分析和質量屬性研究奠定堅實基礎。
>30 個兩性電解質覆蓋pH 2.5-12.0和>40 個pI標記物從2.85 到 11.20。
定制的兩性電解質可根據要求匹配之前使用其他兩性電解質的歷史icIEF分析圖譜。
針對復雜蛋白如 ADC、雙特異性抗體、融合蛋白、AAV和脂質納米顆粒進行優(yōu)化，確保結果可靠且可重復，保證長期穩(wěn)定的供應。
圖8: 現有的載體兩性電解質產線圖
圖9: AESlyte載體兩性電解液用于NISTmAb和Etanercept
圖10: 現有的 pI 標記物產線
提升質控需求，助力應對出海挑戰(zhàn)
電荷異構體分析中，icIEF分析方法能滿足國內外法規(guī)要求，icIEF-Orbitrap聯用技術能進一步提升對生物制藥的質控水平，生物制藥頭部跨國企業(yè)多家均配備了該套方案，以用于對生物制藥中電荷異構體雜質的管控，該方案能進一步引領分析技術水平的提升，幫助國內生物制藥企業(yè)應對新藥出海的挑戰(zhàn)，增強競爭力！掃碼下方二維碼，一鍵獲取icIEF-MS電荷異構體檢測最新方案！
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